核酸药物——问答篇

近年来，核酸药物已成为全球研发和投资的重点领域。相较于在蛋白层面进行疾病干预的传统药物，核酸药物能在遗传信息传递源头发挥作用，因此具有特异性强、基因靶点丰富、疗效持久等优点，有望开启继小分子药物和抗体药物之后的第三代药物浪潮。由于核酸类药物与小分子药物和抗体药物差异较大，各类术语会给很多刚入行的小伙伴造成困扰，本文对核酸类药物相关概念进行梳理，帮助大家了解核酸领域。

1.什么是核苷酸（Nucleotide）、核苷（Nucleoside）、核酸（nucleic acid）?

· 核苷酸（Nucleotide）由一个含氮碱基（nitrogen-containing base）、一个含五碳糖（five carbon sugar）和一个磷酸（phosphoric acid）分子组成。

§ 碱基根据母核结构分为两类，嘌呤（Purine）和嘧啶（pyrimidine），嘌呤包括腺嘌呤（adenine）和鸟嘌呤（guanine）；嘧啶包括胞嘧啶（cytosine）、胸腺嘧啶（thymine）和尿嘧啶（uracil）。

§ 核糖分为两种，分别是核糖（Ribose）和脱氧核糖（deoxyribose），含核糖的核苷酸称为核糖核苷酸（ribonucleotide），是组成RNA的基本单元；含脱氧核糖的核苷酸称为脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide），是组成DNA的基本单元。

· 核苷（Nucleoside）是核苷酸去掉磷酸分子，根据磷酸分子的数量，核苷酸（Nucleotide）可以分为核苷单磷酸（Nucleoside monophosphate）、核苷二磷酸(Nucleoside diphosphate)、核苷三磷酸（Nucleoside triphosphate）。

· 核酸（nucleic acid）是人类的遗传物质，是由核苷酸（Nucleotide）通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的聚合物。

2.什么是核酸类药物(Nucleic Acid Drug)?核酸类药物是指利用核酸分子的翻译或调控功能所开发的药物，由核苷酸链条通过各种剪切修饰及各种载体来发挥药理作用。小分子和抗体药物将“蛋白质”作为药物靶点，人体内许多“致病蛋白”为不可成药靶点，因此许多疾病缺乏有效的治疗手段。核酸药物有望解决“不可成药”靶点带来的未被满足的临床需求，将成为继小分子和抗体药物后的第三类主要药物。根据功能可以分为：

基于DNA的，称为基因治疗，包括在体基因治疗和离体基因治疗（细胞治疗）。目前该技术比较成熟，已有几十种药物上市。

基于RNA的，称为RNA药物，根据机理和分为（包括但不限于）：以编码蛋白质为目的，例如mRNA；以核酸（DNA或者RNA）为靶标的，例如ASO，或者RNA干扰（siRNA或者miRNA）；以蛋白质三维结构为靶向，为适配体药物。

3.什么是寡核苷酸(oligo- or oligonucleotide)?寡核苷酸(oligo- or oligonucleotide)通常指实验室合成的DNA或者RNA片段，是由十几个到几十个核苷酸串联组成的短链核酸， 寡核苷酸广泛用于生物化学、生物学、医学分子检验、基因组学和其他分子生物学实验。在生化实验中，寡核苷酸主要有如下两类用途：

Primers引物：是一小段DNA或RNA，用于pcr扩增，作用是在扩增中作为核苷酸链延伸的起点。

Probes探针：用于标记扩增产物，带可检测的荧光分子，能特异性结合扩增产物，发出荧光信号被仪器检测到。

4.什么是寡核苷酸类药物?

寡核苷酸类药物，也称为小核酸药物，是由十几个到几十个核苷酸串联组成的短链核酸，作用于pre-mRNA或mRNA，通过干预靶标基因表达实现疾病治疗目的。目前小核酸药物主要包括siRNA药物（small interfering RNA）和ASO药物（antisense oligonucleotide，反义核酸）。

与短链的小核酸药物相对的是长链核苷酸药物（mRNA药物）。

5.什么是化学修饰性核苷(modified Nucleoside)?未经化学修饰的寡核苷酸药物成药性通常不理想，它们具有较差的PK 特性，比如稳定性差，易被核酸酶降解；极性大，很难进入细胞，分布特性差；对目标RNA 的结合亲和力不佳。为了达到临床效用，寡核苷酸必须经过化学改造。

按照修饰位点分类：不同位点修饰会产生不同的药理效果

► 磷酸骨架（backbone modifications）:磷酸骨架最常用的化学修饰是硫代磷酸，即将核苷酸中磷酸骨架中的一个非桥氧用硫进行替代，PS改造基本不影响核酸药物的活性，但可以抵抗核酸酶的降解，而且该改造可增强其与血浆蛋白的结合能力，降低肾脏清除速率，提高半衰期。PS是第一代ASO药物中常见的化学修饰，现在依然经常在核酸药物中使用。但经过PS改造后，核酸药物与互补核苷酸链的亲和力会变差，因此需要后续的化学修饰来改善。

► 核糖：第二代的化学修饰主要集中在核糖的结构中，对核糖结构中2位的羟基/氢进行改造，常见的改造包括2’-MOE（在siRNA中应用较少）、2’-OMe、2’-F，这些改造可进一步增强对核酸酶的抵抗，并可以增强其与互补核苷酸链的结合能力。

► 核糖五元环改造：对核糖的五元环进行改造被称为第三代的化学修饰，包括LNA（locked nucleic acid）、PNA（peptide nucleic acid）、PMO（phosphoroamidate morpholino oligomer），这些改造可以进一步增强核酸药物对核酸酶的抵抗、提高亲和力和特异性等。由于PNA和PMO为电荷中性，其与血浆蛋白结合能力较弱，因此容易被清除，半衰期较短，但其可以与一些基团共价结合以提高核酸药物进入细胞的效率，包括脂类、肽类、适配体、抗体以及GalNAc等。

► 碱基：核酸药物对碱基改造的耐受性较差，但对碱基的改造也在尝试中，如胞嘧啶甲基化可提高其解链温度（melting temperature），其已经被应用在ASO药物的设计之中。

► 末端改造：为避免核苷酸链被核酸外切酶降解，需要对核苷酸链末端进行保护，包括3’端添加反式胸苷（inverted thymidine），或者在末端添加软脂酸或偶联芳香化合物。

从发展历程分为三代：经过数十年的积累，寡核苷酸的化学修饰发展了3代技术。常用的化学修饰是第一代的硫代磷酸酯和第二代的甲基膦酸酯，膦酸甲酯不带电，因此比天然DNA或RNA更具亲脂性，并且可以更好地穿透细胞。后续又产生了第三代PNA、LNA等技术。

6.什么是保护性核苷(Protected Nucleosides)?在寡核苷酸合成人工合成过程中，为了防止不必要的副反应，核苷中的所有其他官能团必须通过附加一个保护基团。寡核苷酸合成的效率很大程度上取决于核苷酸磷酰胺上的保护基团, 这些保护基必须仔细地选择和选择性地并入不同的位置，例如碱基上的外环氨基，以及羟基的5’和2’位置。在寡核苷酸链组装后，所有的保护基团被去除以产生所需的寡核苷酸。

7.什么是亚磷酰胺(Phosphoramidites)?亚磷酰胺是一种特定的保护性核苷，是目前寡核苷酸合成的标准化合物，可以在一个极其简单和极其有效的循环反应中按顺序向DNA 链添加新的碱基。与以往的保护性核苷相比，合成效率更高，副产品更少。

上图是一个标准的标准2’-脱氧腺苷磷酰胺的结构。

绿色: 在脱氧核糖上保护5’羟基的二甲氧基三甲基(DMT)基团，在酸性条件下很容易被切割。

黄色: 二异丙基氨基在唑催化剂存在的情况下，在一个近乎瞬间的反应中去除磷酰胺和生长中的寡核苷酸。

橙色: 一种2-氰乙基，保护亚磷酸盐上的第二羟基，在温和的碱性条件下很容易除去。

粉红色: 保护含氮碱基中氨基的可变基团，如2-氰乙基，在碱性条件下最终被去除。