化学合成siRNA：合成路线、纯化方法及质量控制

RNA 干扰（RNAi）是一种小 RNA 抑制特定基因表达的过程。其中，siRNA 是一种 RNA 分子，可以高度特异性和效率地沉默基因表达。因此，它被广泛用于生物医学研究和药物开发。化学合成是获得 siRNA 分子的重要方法，可以提供大量均匀和纯净的 siRNA 产品。

合成路线

siRNA 的化学合成通常从固相合成开始，即在固体支持上使用一系列化学反应合成 siRNA。固相合成 siRNA 的两种主要方法是磷酸酰胺酯法和 H-膦酸酯法。抗病毒机制

磷酸酰胺酯法

磷酸酰胺酯法是 siRNA 化学合成中最常用的方法之一。它的基本原理是使用磷酸二酯或磷酸三酯试剂与核苷酸进行酯化反应，形成磷酸酰胺酯键。这种反应需要使用亲核碱催化剂（如四乙基氨基催化剂）和有机溶剂（如二甲基亚砜或乙腈）进行。磷酸酰胺酯法的优点是反应条件温和，产物易于纯化，且适用于长链 siRNA 的合成。然而，由于酯化反应速度较慢，且磷酸酰胺酯键相对不稳定，导致产物可能存在分解和降解的问题。

H-膦酸酯法

H-膦酸酯法是另一种 siRNA 合成中常用的化学合成方法。它的基本原理是使用 H-膦酸酯试剂与核苷酸进行反应，形成 H-膦酸酯键。这种反应需要使用亲核碱催化剂（如三乙基胺或异丙胺）和有机溶剂（如 DMF 或 ACN）进行。H-膦酸酯法的优点是反应速度快，产物相对稳定，且适用于短链 siRNA 的合成。然而，由于 H-膦酸酯键易于水解，在制备和纯化过程中容易受到水分的影响，导致产物纯度和活性可能受到影响。

主要步骤

固相支持：在合成开始之前，需要将核苷酸和其他试剂固定在固相支持材料上。固相支持材料通常是一种聚合物微球，如三乙基乙烯基苯乙烯（TEVB）或羧基甲基丙烯酸（CM）。

脱保护：核苷酸在合成过程中会使用保护基进行保护，以防止它们在不适当的位置上发生反应。在完成 siRNA 的合成后，需要去除这些保护基。脱保护的方法通常使用亲核试剂（如氨水或甲醇）或酸性条件（如三氯醋酸）。

合成：在去除保护基后，核苷酸会与其他试剂进行化学反应，逐渐合成 siRNA 序列。常用的反应包括磷酸酯化、磷酸酰化、亲核取代和互补杂交等。

洗涤：在每个步骤完成后，需要使用洗涤剂（如丙酮或甲醇）去除剩余的试剂和中间产物。洗涤过程有助于确保最终产物的纯度和纯净度。

纯化：在合成过程结束后，需要使用纯化方法去除副产物和杂质，以获得纯净的 siRNA。常用的纯化方法包括 HPLC、离子交换层析和凝胶电泳等。

纯化方法

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是化学合成 siRNA 中最常用的纯化方法之一。它是一种基于极性差异的色谱分离技术，可将 siRNA 产品与杂质分离出来，从而提高产品的纯度和质量。

原理

RP-HPLC 是一种以反相作为分离机理的色谱技术，其分离原理是基于溶剂的极性差异。反相柱中的固定相是一种亲水性较强的极性基质，需要使用非极性的有机溶剂进行洗脱。在 RP-HPLC 中，样品溶解在有机溶剂中后，随着流动相中溶剂极性的降低，样品分子逐渐进入固定相中，最终被分离出来。

应用

在化学合成 siRNA 中，RP-HPLC 是一种常用的纯化方法。它可以从反应体系中分离出 siRNA 产物，同时去除杂质和未反应物质。RP-HPLC 可以在 siRNA 合成的各个阶段进行应用，如去保护基、合成、脱保护等步骤。在某些情况下，RP-HPLC 也可以用于监测反应进程和产品纯度。使用 RP-HPLC 可以使得 siRNA 产品的纯度达到较高水平，从而保证其在细胞实验和体内实验中的准确性和可靠性。

其优点包括分离效果好、分离速度快、重复性好、分离度高、可以进行批量操作等。同时，RP-HPLC 也存在一些缺点，例如设备成本高、需要消耗大量的溶剂和柱子、不同的 siRNA 产物可能需要使用不同的条件进行纯化等。此外，如果不正确地操作 RP-HPLC，可能会导致产物降解或者缺失等问题。

质量控制

1.合成反应控制：化学合成 siRNA 的过程中需要进行多个化学反应，包括酯化、磷酸化、脱保护等步骤。在每个反应步骤中，需要严格控制反应时间、反应温度、反应物摩尔比等参数，以确保反应的完整性和产物的纯度。

2.脱保护控制：在 siRNA 合成的过程中，需要使用各种保护基对亲核位点进行保护，以防止不必要的反应发生。在脱保护的过程中，需要严格控制反应条件，以确保去除保护基的同时不会破坏产物的化学结构。

3.溶剂控制：化学合成 siRNA 的过程中，不同的反应需要使用不同的溶剂。在选择溶剂的过程中，需要考虑到溶剂的纯度、稳定性以及对反应物和产物的影响，并严格控制每一步反应中的溶剂使用量和浓度。

4.纯化和检测控制：对于化学合成的 siRNA，需要进行严格的纯化和检测。在纯化的过程中，需要选择合适的方法，如 RP-HPLC、离子交换层析等，以去除杂质和不纯产物。在检测的过程中，需要使用可靠的技术，如质谱、电泳等，以验证产物的纯度和序列。

5.结构鉴定控制：对于化学合成的 siRNA，需要进行严格的结构鉴定，包括碱基序列、磷酸化位置等。在鉴定的过程中，需要使用可靠的技术，并对结果进行比对和验证。